本特色研究中心規劃三大主軸的發展重點，以上、中、下游整合及相互支援為推動策略，113年期收穫豐盛成果：

主軸一、動物健康生技研發(子計畫 1-3)>>

畜產與水產業為了動物的健康及預防傳染病，在飼料中添加各種抗生素已是普遍現象，進而造成抗生素濫用的問題，極易造成藥物殘留以及細菌抗藥性增強。因此找尋新穎的抗菌、抗病毒與抗發炎物質並取代抗生素是最迫切的產業需求。並開發新式的葡萄糖誘導酵母菌生產釋泌型功能胜肽平台與建立乳蛋白水解技術及克弗爾菌元共生發酵系統，建構不同發酵產程分解乳蛋白為各式短鏈胜肽群;開發抗菌與抗病毒胜肽之動物乳腺表現系統，利用基因編輯技術將抗菌與抗病毒胜肽之基因片段進行串接，建構於 αLA-乳腺表現載體系統，並於動物泌乳中取得高量功能性胜肽。並與主軸二的動物細胞驗證平台與水畜產動物生理功能驗證平台合作，進行一系列的抗菌與抗病毒測試及臨床動物的抗發炎與抗氧化及促鈣吸收試驗。研發成功之胜肽產品亦將與主軸三的鳥禽保種團隊合作，應用於禽類的飼料添加物之產品開發。

主軸二、動物健康監測與功能驗證平台(子計畫 4-6)>>

現今鳥禽疾病相當繁多，有些病原也同時是人類疾病的重要來源，有鑑於目前沒有廣泛可行的快速檢測方法，本主軸計畫將研 發建立高效率以及涵蓋性廣的鳥禽類疾病監測平台，以及進一步阻斷動物-人類之傳播鏈。並將家禽產業之需求搭配免疫學創新研究進行產業結合，以樹突細胞作為篩選平台，針對飼料配方、飼料添加物及營養補充品進行改善評估研發，以提升禽類免疫能力及維持免疫系統作用為目標，開發天然物語飼料添加物以方便產業上的應用。

主軸三、鳥禽遺傳資源開發與應用(子計畫 7-9)>> 

本主軸的子計畫為鳥禽遺傳資源核心計畫，負責台灣土雞種原保存與產業應用推廣的工作。為鳥禽實驗動物的遺傳資源中心整合各動物園、鳥園等生物資源，建構代養與諮詢服務平台。以次世代定序技術探討族群演化、並建立基因體資料庫，以加深對於雞的演化與不同雞群之馴化進程能有更多的瞭解。並導入CRISPR/CAS9基因編輯技術，用於發展特定位點之點突變品系，可以避免繁複之PGC幹細胞養殖與篩選過程。此外，採用蛋白質體學以及轉錄體學，對羽毛的毛囊特異性基因進行篩選，於子計畫八之動物基因編輯與保種生物技術平台，協助構築過表現以及減弱表現之基因載體，確認候選基因之功能。
 

113年度學術研究成果： 

● 新穎葡萄糖誘導酵母菌量產技術產製Lactoferrin蛋白具高抗菌及抗腫瘤功效

利用嗜甲醇性酵母菌生 產平台(Pichia pastoris)的高細胞發酵濃度及高蛋白質釋泌能力，量產各物種具抗菌抗病毒功效的Lactoferrin蛋白包括人類(hLF)、牛(bLF)、豬(pLF)、狗(dLF)及其各式衍生肽(LFcin)，各種LF蛋白的結構與功能分析近五年已發表15篇頂尖期刊的研究論文，本年度進一步改善甲醇誘導系統的缺失(平均87 mg/L產量)，改為葡萄糖誘導啟動子的新穎平台，增加產品安全性及提高30倍以上的蛋白產量 (高達2.8 g/L)，透過細胞離心及發酵液膜過濾系統，經HiTrap管柱FPLC分離可以達到92%高純度蛋白(圖A-C)，研究顯示具有高抗菌力(anti-E. coli, S. aureus, C. albicans) (圖D)、高三價鐵(Fe³⁺)的結合力、高抗病毒能力(anti-HBV, EV71,小豬流行性下痢病毒/PEDV,雞傳染性法氏囊病毒/IBDV)，以及促進肺癌(A549)、乳癌(MDA-MB-231)、肝癌(Hep3B)等癌細胞凋亡作用(圖F-H)。量產技術已取得專利及技轉給豐展生技股份有限公司，生產取代抗生素之抗菌抗病毒飼料添加物製劑。

新穎葡萄糖誘導酵母菌量產技術產製LF蛋白及衍生肽的抗菌及抗腫瘤分析
 

● 促進生長與代謝之消化酵素研發:『開發益生菌發酵大豆殼作為雞隻機能性飼料原料及建構 Ost1α酵母菌多套載體以提升α-半乳糖苷酶之量產』

機能性飼料可以補充禽畜之營養、提高飼料效率及促進其生長、有效減少抗生素及藥劑之使用、防止飼料品質的降低及提高消化作用之效率而降低了整體廢棄物之產生等目的而微量添加於飼料之物質。畜禽動物以不當的飼養方式與惡劣畜舍環境可能造成緊迫，同時病原菌與環境的抗原亦可能造成動物產生全身性或局部發炎反應，進而影響整體之動物生長表現。本研究以貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)發酵大豆殼(Fermented soybean hull, FSBHB)，以評估未來應用對動物的生長性狀、腸道型態、腸道菌相、抗氧化能力與免疫調節等影響。以60%水分、37℃、96小時作為發酵條件，經發酵後的總酚含量提升0.43 mg of GAE/g DM，在FSBHB經分析 (圖A-C)，明顯提高蛋白酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活性，因此可有效降解大豆中的過敏性蛋白，使可溶性胜肽含量提升1.70%。益生菌發酵豆殼生產之機能性飼料，降解過敏性蛋白及增加可溶性胜肽等機能 性代謝物，可應用於肉雞飼糧。為了進一步提升α-半乳糖苷酶的產量，因此建構了二套及四套 Ost1α 訊號胜肽的酵母菌分泌型表達載體，測試訊號胜肽的多套搭載是否能改善酵素分泌及活性。結果顯示隨著搭載套數增加，α-半乳糖苷酶之活性顯著提升，並呈現出正向關係，這表明多套 Ost1α 訊號胜肽能促進α-半乳糖苷酶之分泌效率並提高其產量(圖D)。本團隊的研究結果為α-半乳糖苷酶工業化生產提供了新策略，具有產業價值。

建構多套及Ost1α訊號胜肽之酵母菌表現載體及FSBHB活性之分析比較

 

● 促進健康之益生菌研發與腸道菌相研究

本團隊已建立一個本土潛力益生菌庫(Probiotic Bank)，並成功分離出具有抗發炎、腸道保健、皮膚保健、抗氧化與抗老化等不同面向之菌株，且成功技轉3個項目與完成2項商品開發上市。於113年度持續擴充本土益生菌庫，配合精準篩菌策略，透過跨主軸子計畫之合作，評估潛力益生菌株之功能，並持續推動商品化，以期能應用於改善人類與動物健康，貢獻於學術與產業應用。

(1) 減緩氧化誘發雄性生殖障礙之益生菌研究 (子計畫三與子計畫八之跨域合作)
本計畫自傳統性發酵乳kefir菌叢中篩選出多株具有抗氧化功能之益生菌，其中Lactobacillus kefiranofaciens K6與L. kefiranofaciens subsp. kefirgranum K14可減緩雄性萊氏細胞與氧化傷害下之細胞死亡與睪固酮下降，且可在加速老化之小鼠實驗中，減緩體內氧化壓力，以及增強精子活動力與增加體內睪固酮含量。據此，本研究之成果具有商業化潛力，用於改善男性老化與壓力下所造成之生殖損傷與生育力下降，以及可應用於經濟動物的種用公畜，以增進其繁殖力的經濟價值。本成果已進行專利申請，且已有廠商洽詢技轉商化事宜。
(2) 減緩慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)之益生菌開發(子計畫三與子計畫五之跨域合作)
本計畫團隊已開發了數種不同的益生菌組合，並使用腎臟細胞來評估其對於尿毒素誘發毒性與氧化之影響，其中S4組合可在腺嘌呤(adenine)誘發CKD小鼠中，減緩腎臟傷害，並減低血清中尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)與肌酸酐(creatinine)濃度，以及減少尿毒素硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate, IS)之累積與增強腸道屏障。本成果已開始與相關廠商洽談技轉事宜中。

經細胞與動物實驗進行篩選具有減緩生殖障礙與慢性腎臟病之益生菌株。

 

● 新興人畜共通傳染病SFTSV檢測套組技術與次世代疫苗研發平台

研究調查顯示新興傳染病中有75%屬於人畜共通，有鑑於目前沒有廣泛可行的快速檢測方法，本子計畫將研發建立高效率以及涵蓋性廣的疾病監測平台，並聚焦在鳥禽以及重要的動物疾病。113年度對檢測系統構建、抗原及抗體生產有很多進展。發熱伴血小板減少綜合症(SFTS)為蜱媒新興病毒性傳染病，目前尚無特異性的抗病毒藥物以及疫苗，因此精準檢驗試劑為監控病毒在自然界各式動物之盛行率為降低人類感染風險之關鍵策略之一。現今尚無可靠的血清學診斷商用套組，遂以SFTS病毒主要免疫原—抗體核蛋白(NP)為標的，首先大量製備高純度的重組蛋白以及單株抗體，目前已成功開發SFTSV NP的抗體、抗原快篩試紙 (圖4A); 抗體快篩試紙靈敏度高(10-3稀釋)，且不受到檢驗血清的動物物種限制，而抗原快篩的檢驗低限為10 ng (圖4B)。在其他病原的檢驗及平台設置方面，我們所完成的鳥禽流感血球凝集素18型抗原，已經用西方墨點法確認成功(圖4C,E)，並且用專一性H5抗體檢測後，確認會對抗體發生特異性反應，其他型血球凝集素不會反應(圖4D,F)。由於流感型別一直有一些改變，除了常常有流感的疾病大爆發外，也會在各個動物流傳，加上今年臺灣流感在人類大量流行，因此這些不同血清型流感的檢驗就相當重要。本團隊也將陸續收集並構築一些新發生流感抗原，以便隨機有更好的血清型涵蓋性。台灣豬隻及家禽與寵物的飼養規模相當大，是本團隊研發檢測試劑與產製疫苗的重點。

新興傳染病SFTSV的抗體及抗原產製與快速診斷試劑及快篩試紙開發

 

● 動物免疫細胞活性分析平台: 『開發中藥配方桂枝茯苓丸對動物自體免疫性肝炎的抑制發炎細胞浸潤及減少脾臟T細胞活化之活性物質』

家禽傳染性支氣管炎、禽流感、鸚鵡喙羽病等禽類傳染性疾病，對於家禽產業經濟衝擊甚大。目前研究指出，飼料添加天然萃取物或植化物可改善或預防禽類疾病。透過樹突細胞做為抗原呈現細胞，於先天免疫系統透過吞噬作用清除病原體，以抗原呈現過程來調節後天免疫系統，藉由免疫防禦及免疫耐受功能維持動物體內免疫系統平衡，為本團隊的創新研究重點。113年度本研究團隊探討傳統中藥配方桂枝茯苓丸(Guizhi Fuling Wan, GZFLW)，在刀豆蛋白A (Con A)誘導的小鼠自體免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)模型中的治療效果及作用機制。研究發現GZFLW能有效減少肝臟細胞凋亡，恢復抗氧化系統，減輕由活性氧(ROS)累積引起的肝功能損害，並顯著降低促發炎細胞因子(如TNF-α、IL-6)的生成，抑制發炎細胞浸潤，減少脾臟T細胞活化及脾腫大。此外，透過串聯質譜分析技術(tandem MS)鑑定出GZFLW含有15種次級代謝物，本團隊逐一揭示其可能的藥理活性物質。綜合來看，GZFLW展現了顯著的抗凋亡、抗氧化及免疫調節作用，能有效緩解AIH病理狀態，為其在AIH及其他肝病治療中的潛在應用提供了實驗依據，並為後續臨床轉化與應用於治療動物肝炎疾病奠定了基礎。此成果已投稿發表於「Biomedical Journal」期刊。(doi: 10.1016/j.bj.2024.100731. )

中藥方劑桂枝茯苓丸(GZFLW)對刀豆蛋白A(Con A)誘導動物自體免疫性肝炎(AIH)的保護作用之機制示意圖

 

● 魚類逆境適應與生理功能驗證平台:『MSPP肌肉生長前胜肽添加於飼料對虱目魚成長與肝醣合成之影響』(子計畫一與子計畫六之跨域合作)

本子計畫六團隊藉由添加MSPP肌肉生長前胜肽飼料(由子計畫一負責產製胜肽)，餵食淡水與海水虱目魚為期8週試驗期，探討肌肉生長前胜肽MSPP對虱目魚成長與肝醣合成之影響。結果顯示MSPP肌肉生長前胜肽對淡水與海水虱目魚具有不同影響。在淡水馴養虱目魚上，MSPP胜肽可顯著提升其生長率、特定成長率與肝體比(生長指標面)；提升血漿中之生長素(GH)含量、肝臟之肝醣含量 (生化指標面)；降低肌肉中myod, mrf4之基因表現量 (肌肉生長相關指標)；提升肝臟中glut2, pgm1,gs, gp之基因表現量(肝醣合成路徑相關指標)。在海水馴養虱目魚上，肌肉生長抑制素前肽，其成長率雖無顯著但有上升之趨勢，且可顯著提升其肥滿度 (生長指標面)；在血漿中IGF-1之濃度與肝臟之肝醣含量，亦有顯著之上升(生化指標面)；而肌肉中mstnb之基因表現量雖顯著上升，但可顯著提升myod, myog之基因表現量 (肌肉生長相關指標)。總結，MSPP肌肉生長前胜肽可提升淡水虱目魚之成長表現與肝醣合成能力；此外，可提升海水虱目魚之肌肉分化增生指標，進而提升其肉質。目前已開發成水產添加劑產品。

MSPP肌肉生長前胜肽對虱目魚之研究，證實可提升淡水虱目魚生長與肝醣合成，以及提升海水虱目魚之肉質

● 遺傳資源保種與產業利用:『育成中興紅羽1982土雞品種推廣於原鄉部落飼養並協助建立地方土雞品牌肉品』

子計畫七團隊目前保有22個土雞品種以及近千個體之DNA遺傳資源，專注於台灣土雞的保種及產業的推廣應 用，近年來，以「中興紅羽1982」土雞命名，本中心團隊與飼養的部落密切交流合作，已穩定飼養與販售，平均每一年出售雛雞達2.5萬隻以上。2023年中華民國養雞協會也加入推廣的行列，協助舉辦「第一屆1982中興紅羽土雞年會」。今年(113年度)在宜蘭南澳部落舉辦第二屆年會，除了相互的交流以外也到部落養雞地點實際訪查，互相學習養雞環境的優點以及巧思。產品推廣是現階段的重點，本中心與中興大學實習商店以及農資學院畜產試驗場合作。將部落飼養雞隻送至畜產試驗場的家禽氣冷式屠宰場，經過人道屠宰後依照訂單分切及包裝出貨。氣冷式屠宰有別於傳統水冷式的屠宰，降低細菌數量以及防止屠體間的交叉污染，擁有更佳的食品衛生安全。消費者透過APP先和實習商店預購部落飼養的中興紅羽1982，選擇冷藏或冷凍的方式出貨，近期更是加入分切的選擇，讓消費者可以更容易烹調土雞。另外也邀請達觀部落德瑪汶協會到實習商店舉辦土雞料理試吃活動，讓消費者可直接感受到中興紅羽1982的滋味。

本團隊於興大實習商店舉辦的土雞料理試吃活動，於奧萬大與南澳部落舉辦中興紅羽1982土雞年會並逐年優化飼養場地設置棲架強化雞群之動物福利。

● 動物保種生物技術:『開發溫感水膠快速純化鳥禽生殖幹細胞之新穎技術』

團隊已建立雞生殖腺再生活體培養技術，發展出新型「基因轉殖禽類產製方法及應用」，並已獲得本國專利(發明第I557227號)。使用此平台的外源性始基生殖細胞可以是經過基因編輯的細胞，也可以是相近體型鳥類的異種生殖細胞。所以此平台除可用於產製基因編輯動物也可用於繁殖力較弱的品系保存。113年度本團隊發展一新穎的溫度敏感性水膠係能於32-37℃間由液態轉為膠態，而在10℃以下呈現液態，與傳統的明膠或瓊脂物理形質相反，且不具有生物毒性。水凝膠於添加SDF1 (stromal cell-derived factor 1)後形成之膠體，將鳥禽胚胎之生殖腺置於該膠體上方培養，鳥禽生殖幹細胞能夠被吸引而自動遷移到水膠內生長，並且不影響具分化能力之細胞的活性。傳統利用特殊生殖幹細胞培養基進行篩選的方式，需要將取自鳥禽胚胎獲得的混合細胞群，培養超過14天，才能獲得純度>80%的生殖幹細胞族群。使用這個方法，可以於24小時內獲得純度>99%的生殖幹細胞，可即刻進行冷凍保存。若需要更多的生殖幹細胞，則可延長至48~72小時。冷凍保存之生殖幹細胞可待有需要時，再進行解凍後，移植入特別培養之宿主，進行復育。特別是目前鳥禽的生殖幹細胞僅有雞和鴨有發展出特用幹細胞培養基，可進行長時間培養；而其他物種之生殖幹細胞皆無法培養超過一週的時間，所以使用傳統的方法，無法獲得高純度之生殖幹細胞進行冷凍保存，使用此溫感水膠並搭配SDF-1的使用，可以克服這個時間上的限制，讓使用生殖幹細胞保種變為可行。此方法已獲得中華明國專利(發明第I812214號)。

(A)溫感水膠、SDF-1與Agar配置示意圖, (B)細胞比例變化圖, (C)純化冷凍保存之生殖細胞，解凍後仍可遷入宿主之生殖腺的細精管內，並產生精子。

● 鳥禽組織功能之季節性再生發育:『探討決定紅腹錦雞羽毛形態與色素形成之關鍵因素』

鳥類之繁殖期具多樣性，有春季繁殖者(番鴨、鴛鴦)、秋季繁殖者(鵝)、春/秋雙季繁殖者(綠頭鴨)以及全年度繁殖者(菜鴨、家雞)等四種生殖調控方式，其性腺會於一年內重複退化與再生。113年度本團隊旨在探討決定紅腹錦雞羽毛形態與色素形成之關鍵因素。由動物頭頸部、背側、腹側與鞍部收集正在生長的羽毛毛囊，分析分子差異表現。qPCR結果顯示agouti訊號蛋白(ASIP)基因於頭部與腹羽中之表現顯著較高，相反地，酪胺酸酶相關蛋白1(TYRP1)顯著較低；Scarb1與CYP2J19於頭部羽毛中之表現顯著較高。免疫組化結果顯示腹紅羽毛的頸圈、分枝帶與倒刺脊中均未檢測到TYRP1之表現，但全身五個區域之毛囊中均表現MITF，顯示褐黑素為腹羽之主要色素。此外，解剖頭部與腹側羽毛毛囊組織(含上皮領及真皮乳頭)，相互交換移植並觀察三個月時間，發現移植之羽毛於異位區域仍以原來之形態生長，顯示上皮領含有羽毛毛囊底部之活性細胞。得知羽毛發育過程中負責羽毛色素形成之分子於上皮環中特別活躍，故羽毛色素與形態均受毛囊上皮環之調節。
（此研究發表於2024年Advanced Multidisciplinary Agricultural Biotechnology Conference，獲得競賽優勝獎）。

應用不同部位羽毛毛囊組織相互交換移植，以qPCR與免疫組織化學染色法，檢測紅腹錦雞不同區域羽色之基因與蛋白質表現差異及其分子調控。

112年度學術研究成果：

 ● 新穎抗菌抗病毒與抗發炎功能性胜肽研發

本團隊利用乳鐵蛋白(Latoferrin)對於硫代乙醯胺 (thioacetamide, TAA) 誘導下是否具有肝纖維化與慢性肝損傷之保護作用。結果顯示利用口服管胃餵食300 mg/kg, 900 mg/kg乳鐵蛋白有助於預防TAA誘導SD大鼠肝纖維化，於Q RT-PCR檢測亦發現α-Sma, Collagen I, Ctgf, Timp-1, Mmp-2, 和 Mmp-9 等多個與肝纖維化相關基因亦有下降之趨勢; 除此之外，本團隊利用FL83B小鼠肝臟細胞模式尋找相關途徑。總結，乳鐵蛋白具有抗氧化、抑制肝臟發炎反應、降低肝纖維與膠原蛋白的累積。此一成果，已經投稿於「Biomedicine & Pharmacotherapy」期刊。

乳鐵蛋白用於TAA誘導肝臟纖維化動物模式的研究，證實透過抑制肝星狀細胞活化與抗發炎機制，具有預防肝臟纖維化與慢性肝損傷之保護作用。

● 益生菌發酵物生產之機能性飼料添加物及酵母菌表面呈現系統

本計畫探討益生菌發酵物生產具免疫調節、抗氧化及抗菌之機能性飼料添加物及研發酵母菌之葡萄糖誘導啟動子 (GTH1 promoter)之多套表現載體及酵母菌表面呈現系統表現消化酵素(脂肪酶及半乳糖苷酶)。本計畫已完成益生菌特性分析、建立益生菌配合植酸酶發酵物(酵素菌粉)生產製備流程、完成發酵物之酵素活性分析與抗氧化能力評估及無機磷釋出等試驗。計畫第二個主題，已研發酵母菌之葡萄糖誘導啟動子之多套表現載體及表面呈現系統將脂肪酶及半乳糖苷酶由酵母細胞壁鑲嵌蛋白 pir1呈現於酵母菌細胞壁，脂肪酶之活性(327252 U/ L)及半乳糖苷酶之活性(281354 U/L)。本研究建立之酵母菌表面呈現系統，不僅大幅減少酵素蛋白量產步驟及生產成本，量產之脂肪酶及半乳糖苷酶可耐高溫及耐酸鹼，具產業化價值。在臨床試驗，發現小豬飼料添加耐高溫及耐酸鹼之脂肪酶，在人工乳期間、保育及肥育期間日增重、採食量、生長速度、毛色亮度、豬隻整齊度及健康程度顯著優於對照組。
益生菌發酵物具免疫調節、抗氧化及抗菌之機能。飼料添加物及研發酵母菌之葡萄糖誘導啟動子之多套表現載體及酵母菌表面呈現系統表現脂肪酶及半乳糖苷酶。

 

● 開發可活化芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor)具有抗發炎功效之益生菌Lactobacillus kefiranofaciens K50

本計畫自酒精性傳統發酵乳克弗爾(kefir)中篩選出可藉由AhR增強角質細胞屏障之益生菌L. kefiranofaciens K50，且發現菌株之後生元(postbiotic)發酵上清液可分別於巨噬細胞株與嗜鹼性球細胞株實驗中展現抗發炎與抗過敏之功效，並可減緩發炎環境中皮膚角質細胞之凋亡，且進一步於小鼠化學性誘導之異位性皮膚炎模式中，減緩發炎之症狀。開發可減緩黃麴毒素毒性之抗發炎益生菌Lacticaseibacillus paracasei RM081。本計畫第二個研究發現L. paracasei RM081具有6種可與黃麴毒素結合之蛋白質，且可在腸道、肝臟細胞與雄性生殖細胞實驗中，減緩黃麴毒素之毒性。進一步由黃麴毒素攻毒小鼠試驗中可知， L. paracasei RM081於不同劑型下，包括活菌、細胞內容物、熱致死菌體與發酵上清液，在口服給予後，皆在活體中具有減緩黃麴毒素之能力。
益生菌可透過活化AhR減緩異位性皮膚炎，並與黃麴毒素結合以減緩毒性。

 

● 利用桿狀病毒表面展示系統(Baculovirus surface displayed system)成功建立針對流感病毒之新型檢測平台

桿狀病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)是一種生物安全等級為1 (BSL-1)的昆蟲病毒，能夠大量表現具有適當折疊和轉譯後修飾的真核重組蛋白。利用此系統，我們已成功將流感病毒所有18型的血球凝集素(Hemagglutinin, HA)及11型的神經氨酸酶(Neuraminidase, NA)分別展示在昆蟲細胞膜表面上以進行鳥禽抗體濃度之檢測。後續可藉此系統生產抗原、疫苗、檢驗平台以減少病毒的侵害。除了桿狀病毒，另一主軸研究目標為建構載體病毒，目前已經建構具有螢光訊號之流感病毒兩式(H1N1-GFP，H6N1-GFP)以及羊副痘病毒(ORFV-eGFP, ORFV-RFP)之載體；此類病毒感染僅需以螢光顯微鏡觀察即可直接追蹤感染情況，適用於中和抗體偵測以及抗病毒藥物開發。此外，以上兩式ORFV也已經剔除基因體中的毒力基因(VEGF或CBP)，經動物模式證實病毒感染能力已弱化，為理想之活毒減毒病毒載體，未來將應用於生醫用途，例如：雙價疫苗或者溶瘤病毒載體。

利用桿狀病毒表現系統(A)表現流感病毒之血球凝集素及神經氨酸酶於病毒表面(B)及細胞表面(C)，並利用此系統針對鳥禽血液中的流感病毒感染進行抗體分析(D)。

 

● Erianin透過抑制 Th17 細胞分化減緩膠原蛋白誘導小鼠的關節炎

子計畫五研究團隊專注於動物免疫細胞活性的探討，其中一項重要成果是對Erianin的研究。我們發現erianin藉由調節naïve CD4+T細胞分化成Th17細胞活化與分化過程，這是一項對免疫調控極為重要的功能。而在膠原蛋白誘導小鼠關節炎（CIA）模式，erianin透過抑制JAK/STAT3途徑，影響RORγT的轉錄，進而有效減少IL-17A細胞因子產生，為治療類風濕性關節炎（RA）提供了新的治療方向。此外，我們研究還證實，erianin治療後能夠降低CIA小鼠體內促發炎細胞因子的表達，同時改善關節組織的病變，並抑制Th17細胞的分化。這項研究的重要性體現在erianin在對抗CIA表現出與現階段RA臨床治療方法（methotrexate）相似的效果，甚至在小鼠體重減輕方面表現較為輕微，顯示可能改善了食物攝取或食慾。這為Erianin作為單一治療方法或合併治療策略的應用提供了堅實的支持，有望提高患者的治療效果。我們的研究論文「Erianin alleviates collagen-induced arthritis in mice by inhibiting Th17 cell differentiation」已於2023年9月4日在Open Life Science期刊上發表。
第二型膠原蛋白誘導小鼠關節炎（CIA）動物模式建立及Erianin改善CIA關節炎的分子機轉。
 

● 洋菜適於作為廣鹽性虱目魚測試功能性添加物的飼料包覆劑

虱目魚為廣鹽性魚類，能生存在淡水及海水環境中，且為台灣重要經濟魚種之一。養殖實務上普遍認為馴養於淡水環境之虱目魚生長速度較快，但飼養在海水則肉質較為鮮美，因此透過飼料添加物來兼顧兩者優點成了重要研究課題。洋菜(Agar)為植物性膠質，容易取得且在常溫時成膠狀、高溫才融化，因此具有潛力作為測試功能性添加物的飼料包覆劑。本研究擬分別對馴養在淡水和海水的虱目魚投餵洋菜包覆飼料六週，比較洋菜包覆飼料對淡水與海水虱目魚生長與生理的影響。結果顯示洋菜包覆飼料對淡水與海水虱目魚的成長表現、抗氧化機制以及免疫反應都沒有造成顯著的變化，並確認洋菜適於作為測試功能性添加物的飼料包覆劑。

從生理數據及mRNA表現量分析顯示，洋菜包覆飼料對淡水與海水虱目魚的成長表現、抗氧化機制以及免疫反應都沒有造成顯著的變化。

 

● 台灣特色地方土雞的遺傳資源保種與地方創生及林下經濟之產業利用

本年度在雞隻種源發表兩篇期刊，一篇比較土雞與產蛋雞注射IBV疫苗抗體反應與免疫器官基因表現差異；另一篇討論HOXC8與HOXC10基因，在雞的冠毛(crest)外觀所扮演的角色。在產業應用上，持續推廣中興紅羽1982。今年度媒合德瑪汶協會及中興大學實習商店協力合作本計畫，在部落成長雞隻送至中興大學畜產試驗場氣冷屠宰場進行人道屠宰。氣冷式屠宰也大大較傳統水冷屠宰場節省水資源，且避免屠體間的交叉污染。實習商店以先行宣傳與接受預購訂單，讓消費者容易得到德瑪汶共有雞的相關消息並且方便購買，未來可以直接向部落訂購。在11月舉辦了中興紅羽1982試吃活動，由部落廚房專業烹製土雞料理送到中興大學實習商店，讓顧客可以品嚐中興紅羽1982土雞獨特的風味及細膩的口感，並且駐足停留聆聽1982土雞的故事，建立與顧客間的情感連結。團隊也參加由養雞協會主辦的中興紅羽1982土雞飼養管理與品牌行銷共識營，與全台各地有飼養中興紅羽土雞的部落面對面，交流飼養及行銷過程中所遇到的問題以及各方面的經驗，使所有夥伴能更加瞭解彼此並更有凝聚力。且『中興紅羽1982』榮獲第三屆『國家農業科學獎』。

參與飼養中興紅羽1982部落在奧萬大召開品牌。

 

● 利用SDF-1溫感水膠作為開發雞胚始基生殖幹細胞(PGCs)之高效純化方法，提升PGCs在鳥禽遺傳資源保種與基因編輯之效率

溫感水膠的純化PGC的方式是利用溫感水膠，在37℃會成固態，而在≤10℃中會變成液態的特性，有利於回收細胞降並低對細胞之傷害。我們在溫感水膠中加入了SDF-1。SDF-1是CXCL-趨化因子亞家族的成員之一，SDF-1為CXCR4的配體。在其他實驗室的報導中指出：斑馬魚(Doitsidou et al., 2002; Knaut, Werz, Geisler, & Nüsslein-Volhard, 2003)、小鼠(Ara et al., 2003; Molyneaux et al., 2003)和雞(Stebler et al., 2004)的PGCs遷移乃是由SDF-1/CXCR4 趨化因子信號的調節。PGCs在雞胚胎的位置會根據孵育天數不同而改變，純化的方法會根據生長天數做調整，在過去的文獻探討中傳統的方法為將雞胚胎孵育至HH stage 15-18，此時的PGC會在血液循環中進行遷移，可透過抽取胚胎血液得到PGC，由於此方法需耗費14天等待血球細胞凋亡，因此想利用PGC遷移的調控機制，直接從胚胎中純化出PGC，將胚胎孵育至HH stage 20-22，待多數PGC都遷移到生殖脊，利用溫感水膠和SDF-1混合的膠體，讓PGC遷移到有較高SDF-1濃度的水膠中，回收溫感水膠，再降溫使水膠液化，便可得到純化的PGC。在溫感水膠混合SDF-1純化中，溫感水膠抽取第零天就可以取得>85%的始基生殖細胞，其與胚胎血液純化相比得到了較純的始基生殖細胞，而胚胎血液純化的方法，需要14天才可達到~80%的純度。

經由溫感水膠純化後當天進行細胞免疫螢光染色分析，可以看到大量的始基生殖細胞被分離出來。與兩種純化方式的生殖細胞比例變化圖。

 

● 台灣金雞雉科紅腹錦雞（Chrysolophus pictus）不同身體區域特異性羽色之發育生物學調控機制探究

鳥類身體不同區域具有特異性羽色、花紋與形態，研究指出鳥類羽色與花紋大多是由黑色素調控形成，已知MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) 為生成黑色素路徑之重要轉錄因子，TYRP1 (Tyrosinase Related protein 1) 為生成真黑色素(Eumelanin)之重要調節分子，故本研究旨在探討調控雄性紅腹錦雞區域特異性羽色之分子機制。自頭部、頸部、背部、腹部以及鞍部採集生長中之羽毛毛囊，進行即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time polymerase chain reaction)以及免疫組織染色(Immunohistochemistry, IHC)分析。結果顯示，調控形成褐黑色素(pheomelanin)與真黑色素之上游基因，ASIP於頭部之表現顯著較其他部位高，且五個部位羽毛毛囊之Collar、Ramogenic zone與Growth zone皆表現MITF蛋白質，而僅頭部與腹部毛囊這三個位置未表現TYRP1。綜上所論，雄性紅腹錦雞之頭部與腹部為褐黑色素生成之羽色，而頸部、背部以及鞍部羽毛顏色則為真黑色素形成。(此研究發表於2022年中國畜牧年會，並獲得口頭報告新人獎)

分析紅腹錦雞不同區域羽色之基因與蛋白質表現差異，以了解其分子調控。
 

<<第一期(107-111年)學術研究成果總結>>

本研究中心在第一期(107-111年)執行期間，共計發表349篇學術期刊SCI論文，五年成長率為351%；其中屬於高質量論文(Q1或IF>4.0)論文數為212篇，五年成長率為500%、國際合作發表論文數110篇，五年成長率為450%。又以發表在Cell (2019; IF=41.582;封面故事)、Nature Communications (2020; IF=12.121; Science.CA特別報導)、Microbiome (2020; IF=14.350)、Developemtal Cell (2020; IF=13.417)、Molecular Nutrition & Food Research (2021; IF=6.575;封面故事)等研究成果，廣受重視，成績斐然。

 ● 新穎促鈣吸收及骨質新生的KFP-1胜肽之結構與功能藥理功能研發

       本團隊利用Kefir grain共生發酵水解牛乳或羊乳蛋白產製許多具生理功能的短胜肽，經多年努力找到一條具有促進腸道鈣離子吸收的小分子乳胜肽，命名為「KFP-1小胜肽」。透過分子機制研究確認KFP-1會結合鈣離子，經特殊的TRPV6鈣離子通道由腸道乳糜管上皮細胞吸收，循環到全身骨骼，促進成骨細胞的骨質新生，有效治療各種年齡層不同成因的骨質疏鬆症，包括高齡婦女或男性的骨鬆症、血友病罕遺傳疾病誘發的骨鬆症、以及維生素C缺乏高氧化壓力的年輕族群之骨鬆症。研究論文「KFP-1, a novel calcium-binding peptide isolated from Kefir, promotes calcium influx through TRPV6 channels」，傑出成果發表於2021年11月 24日出版的「Molecular Nutrition & Food Research」期刊，並獲選為當期封面故事的主題，代表研究團隊在胜肽藥理研究的實力。

 ● 促進畜禽健康的益生菌研發與腸道微生物之研究

       本團隊研發酵母菌葡萄糖誘導表現平台及酵母菌表面呈現系統，表現消化酵素及討探討兩種益生菌配合植酸酶發酵生產之益生菌粉添加於肉雞之飼糧。在臨床試驗，發現小豬飼料添加耐高溫及耐酸鹼之脂肪酶，在人工乳期間、保育及肥育期間日增重、採食量、生長速度、毛色亮度、豬隻整齊度及健康程度顯著優於對照組。另外，益生菌試驗分為對照組、添加0.1 % 酵母菌發酵菌粉組、0.1 % 米麴菌發酵菌粉及0.05 % 酵母菌發酵菌粉 + 0.05 % 米麴菌發酵菌粉等4組。每欄含20隻肉雞(每個處理3重複)。結果顯示使用釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或米麴菌(Aspergillus oryzae)之益生菌粉以0.1 %之比例單獨或混合添加於肉雞飼料中。結果顯示益生菌粉可改善肉雞腸道絨毛高度，以米麴菌粉效果較佳，肉雞之白血球(WBC)濃度有顯著的上升。添加益生菌粉後，其尿酸(uric acid, UA)濃度與對照組相比有顯著的下降。所有益生菌組均可作為功能性飼料添加劑，因可增強絨毛:隱窩比率並降低炎症相關的mRNA表達，此一研究成果具產業化價值，目前已技轉給廠商。

  ● 魚類逆境適應及生理調控研究平台之水產健康評估

       本子計畫建立魚類逆境適應環境及生理調控研究平台，與子計畫三「促進健康之益生菌研發與腸道菌相研究」密切合作，首先完成重要經濟魚種金目鱸養殖在海水與淡水中的腸道結構、組織解剖學與菌相分析比較。隨後於今年完成中興大學首座室內AI監控循環過濾養殖房，將以此研究平台進一步探討添加本研究中心成員研發之益生菌飼料、胜肽及酵素飼料添加物產品對於養殖金目鱸、虱目魚等重要養殖魚類之生長與抗逆境影響與作用機制。

● 鳥禽基因編輯產製平台之新育種技術開發

      本研究團隊開發CRISPR/Cas9基因編輯技術應用於動物細胞已相當成熟。基因編輯的幹細胞可用於產製基因轉殖小鼠、基因剔除小鼠、而會造成早期致死缺陷的基因改造，也可以藉由基因嵌合體小鼠的方式來進行分析。相較於基因編輯小鼠如火如荼的進展，基因編輯 家禽的產製則相對顯得緩慢。我們發現最主要的原因在於：由帶有基因修飾的生殖幹細胞所產生的配子，無法有效率的轉變為帶有基因修飾的個體。因此本計畫團隊的研發主軸便聚焦於「外源PGC移植再生技術」，讓異體生殖細胞移植後，能分化成為具有功能性的配子，且降低內源性生殖細胞配子的比例，提升由外源性生殖細胞配子所產生子代的比例。由於雞的睪丸有極強的再生能力，我們利用此特點，在睪丸再生初期，去除內源性生殖幹細胞；讓再生成功的睪丸內所帶有的生殖幹細胞，絕大多數為外源性生殖細胞。以土雞和來亨蛋雞為材料，由於來亨雞的毛色為顯性白，在與土雞的母雞交配時其子代的毛色為白色，而小雞為黃色；而如果父系是土雞，則小雞為褐色。 我們以土雞睪丸為再生的材料，植入外源性來亨雞生殖幹細胞。目前已成功產生出五隻嵌合體公雞，而其子代中有33%~ 65%為由來亨雞精子所產生之子代。此一突破性成果有助於培育鳥禽新品種。

● 鳥禽年輕睪丸細胞具有促使老年睪丸組織獲得重組生精小管的能力

       本研究中心首次證明鳥禽雄性睪丸的再生能力僅存在於年輕睪丸內。為了測試年輕的睪丸組織是否可以改善老雞睪丸組織的再生能力，我們將年輕的睪丸組織和DiI標記的老雞睪丸組織打散並混合在一起共培養三天，培養三天後觀察發現單獨的老雞睪丸同齡組織共培養幾乎沒有增殖細胞和細精小管的結構。然而，與年輕睪丸組織共培養的老雞睪丸組織卻可以再度重組成生精小管的結構，並有細胞增生。這表明年輕的睪丸組織可以通過細胞-細胞連接或旁泌因子的分泌來維持老雞的睪丸組織細胞的增殖和結構。此外，我們在年輕的生精小管中發現了DiI標記的生殖細胞（CVH +），這代表老雞的生殖細胞可以在重組的年輕生精小管和老雞的生精小管中繁殖並存活。老細胞可以在年輕組織的幫助下重塑腎小管結構。通過該結果，我們發現年輕的睪丸組織不僅保持了老雞的睪丸結構，而且還改善了老雞睪丸細胞重整的生精小管。此一成果已投稿至頂尖學術期刊中。 

 

● 鳥禽羽毛之生物物理學研究及仿生科技應用

       本研究中心囊括生物物理的跨領域教師，參與計畫的執行重點為利用已開發之QMorF形態場量化分析平台，進一步進行跨領域探討羽軸結構順應環境的生物力學/物理原理、功能形態連結、演化趨勢、以及結構設計的巧妙法則。重要研究成果包括：(1) 探究羽毛分枝（羽軸、羽枝、羽小枝）之演化與發育機制，及其形態多樣性與空間變異之生物力學與功能效應。(2) 發表QMorF分析系統之方法學，有助於更廣泛應用於分析其他具胞狀結構的生物組織或材料。(3) 於2021年動物行為、生態、暨環境教育研討會發表之「藉綠頭鴨及土雞廓羽之脫水實驗探討鳥類廓羽的形態恢復機制」獲生物學組壁報競賽佳作。(4) 最新成果「鳥類飛羽的形態與力學不對稱性影響其功能表現」於2022年動物行為與生態學研討會中發表。


 

● 鳥禽遺傳資源保種與演化

      雞為重要之生物資源，在農業上，叢林野雞經過馴化之後，雞蛋、雞肉已成為當今人類重要的動物性蛋白質來源，全球一年生產超過200億隻雞以及1兆2千億枚雞蛋；在科學研究與生物技術產業上，雞同樣具有極高之價值。野雞起源於東南亞，家雞是由野雞馴化而來，經歷一連串的遷徙與馴化過程，一些突變基因被保留了下來，形成現今許多品種的重要特徵。雞隻外貌多樣性包括皮膚顏色、雞冠形態、羽毛顏色、羽毛圖案、羽毛結構與分佈等。本中心成員陳志峰教授承接李淵百老師自1982年開始進行地方鷄種之保種與育種長達40年，目前保有22個土雞品種（系）以及近千個體之DNA 。遺傳資源在科學應用上，多樣化之羽毛顏色與圖案，提供了探索鳥類羽色圖案形成之分子機制的動物模式。由毛囊再生過程已證明黑色素幹細胞於毛囊底部呈水平環狀排列，而隨著羽毛之生長做出二維的圖形，再加上周圍組織可能的調控機制，因此形成了美麗又複雜的羽毛圖案 。產業應用上，因為消費者習慣以腳脛顏色、羽毛顏色或是皮膚顏色辨別雞隻種類。因此，應用已知之外貌基因，經由配種系統滿足產業需求，並可做為種雞場種原保護之工具。

● 台灣藍鵲的優雅身影及羽毛發育研究榮登Cell期刊封面 

       本研究中心的六位成員鄭旭辰老師(生科系)、唐品琦主任、陳志峰老師(動科系)、吳平老師(USC)、阮文韜(中醫大)及鍾正明院士(USC)的團隊，在教育部的資源挹注下，歷經多年的努力利用新穎的統計量化分析方法，找出不同形態羽軸的結構和力學性質之差異，解析羽軸中髓質多孔結構的形態分布，並整合羽軸皮質硬殼的幾何與材料量測，發現羽軸將角蛋白集成輕而強韌的複合材料的巧妙策略。成果亮點為：(1) 解析羽毛結構形態發生的生物結構原理，及 (2) 解答飛羽兩大功能性模組:羽軸和羽片之結構優化策略及其如何因應生態挑戰。此重大研究成果刊登在2019年11月出刊的Cell《細胞》期刊中，並獲選為當期的（Cell 179(6), 1409-1423）。團隊成員從分子和細胞生物學角度切入，從羽管形成的不同時間點上採集生長途中的羽毛樣本，並對樣本組織進行次世代定序轉錄組分析，找出與羽側支的末端羽鉤生成相應的基因表達和訊號傳遞。同時以免疫染色學方法檢查羽側支的細胞形態生物訊息分子的表達，發現羽管中真皮乳突組織裡的非對稱WNT信號的表現，是控制羽側支形成小羽支細胞形態的關鍵，當外加的WNT-2b在真皮乳突組織前半部時，會在羽管細胞中觀察到僅有片羽才有的羽鉤特化形態生成，顯示WNT訊號可調控不同形態羽片的生成機制。
 

● 建構禽流感仿病毒之新穎動物健康監測平台

       由於各種動物包括鳥禽疾病相當繁多，這些病原也是人類疾病的重要來源，但目前沒有廣泛可行的檢測方法，本研發團隊建立高效率以及涵蓋性廣的動物疾病監測平台，並聚焦在鳥禽疾病，以利減緩鳥禽損失並可控制疾病傳播。已成功用桿狀病毒將血球凝集素展示到昆蟲細胞上，並證明可以用來檢測血液中的流感抗體。我們也用桿狀病毒將Neuraminidase（神經氨酸酶）展示在桿狀病毒上成為仿病毒，以便檢測血液中的流感抗血清。我們已經將流行性感冒病毒的18型血球凝集素以及9型的神經氨酸酶展示在桿狀病毒上為仿病毒。前者稱為HA-Bac，後者稱為NA-Bac，以便分析被不同流行性病毒感染後的動物之抗血清。由於雞隻生產關係到民生經濟，而雞隻又容易受到流感感染，導致肉雞減產或雞蛋嚴重缺乏。流感的檢驗本來就已經是全球都在進行的工作，但一般都是用流感病毒本身當抗原做檢測，由於流感本身有傳染性，因此相當危險難做，而且檢測都只限於常見的幾個血清型。但流感有很多血清型，每種血清型感染人畜各有不同的專一性或嚴重性。如H5N1或H7N9會從鳥禽感染到人類，一旦被感染會有很高的致命性。因此我們建立用桿狀病毒展示血球凝集素或神經氨酸酶，建立一個安全的病毒相關抗血清的分析平台，比原來常用的檢測系統更加完善與高效率。